Fexofénadine 86

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Ce qui est revendiqué est: 1. Un procédé pour la préparation du composé de formule on soumet le composé de formule à la bioconversion avec une culture de micro-organismes du genre Streptomyces, à un pH de 5,0 à 8,0 pour obtenir le composé de formule I et éventuellement l'isolement ou la purification ou la salification du composé de formules I et II étant deux formes énantiomères ou leurs mélanges. 2. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel la culture du micro-organisme est Streptomyces platensis NRRL 2364. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le composé de formule II est un racémique mixtureof ses énantiomères résultant en un mélange racémique de l'énantiomère de formule I. 4. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel la bioconversion est effectuée à une concentration de 0,5 à 10 g / l du composé de formule II à une température de 26 à 28 ° C avec aération avec un courant d'air d'environ 1 litre / minute et par litre de milieu de bouillon de culture. 5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le pH initial est d'environ 6,5 et évolue vers 9,0 à 8,5 pour obtenir un mélange de triol-phosphate de la formule et le composé de formule I, on soumet le mélange à reductfion à une valeur de 3,5 et 5 pour convertir le composé de formule IIIb en un composé intermédiaire de formule qui évolue naturellement à une valeur de 6,0 jusqu'à ce que le composé de formule IIIb est complètement distribué et en ajustant la même à un pH d'environ 8, pour obtenir le composé de formule I. 6. Le procès selon la revendication 1, dans lequel le pH initial est d'environ 6,5, évolue naturellement à 8,0 à 8,5 et à réduire et à maintenir le pH à 6,3 à 6,8. 7. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le composé de formule I est purifié par extraction avec de l'acétate d'éthyle. Un objet de la présente invention est un nouveau procédé pour la préparation de la fexofénadine. Fexofénadine est un médicament qui possède une activité antihistaminique significative et qui est dépourvu d'effets secondaires. (Efficacité et l'innocuité du chlorhydrate de fexofénadine pour le traitement de la rhinite allergique saisonnière, Bernstein D. I. et al, Ann. Allergy-Asthma-Immunol. (1997) 79 (5) 443-448). Ce composé est le principal métabolite de la terfénadine, lui-même un agent antihistaminique (D. Mc Tavish, KL Goa et M. Ferill, "terfénadine: un examen actualisé de ses propriétés pharmacologiques et de l'efficacité thérapeutique, les médicaments 39, 552-574 (1989)) . Fexofénadine est actuellement préparée par voie chimique, en de nombreuses étapes avec un rendement inférieur à 10% (brevet US. N ° 5.578.610 et 5.581.011). Le demandeur propose donc de trouver une autre voie de synthèse pour fexofénadine. Le choix est alors concentré sur une méthode de bioconversion en utilisant l'un des deux types très spécifiques de micro-organismes suivants: soit le champignon filamenteux de genre Absidia Corymbifera et notamment Absidia Corymbifera LCP 63-1800 ou d'un Streptomyces et notamment Streptomyces platensis NRRL 2364 . la spécificité de la bioconversion avec ces micro-organismes était inattendue: parmi les nombreuses souches étudiées lors d'une projection, ce sont les seuls qui permettent fexofénadine à obtenir avec un bon rendement et peu ou pas de sous-produits. Un objet de l'invention est un procédé pour la préparation des composés de formule (I): caractérisé en ce qu 'on effectue une bioconversion du composé ou des composés de formule (II) est effectuée: soit avec une culture de micro-organismes du corymbifera genre Absidia ou d'une culture de micro-organismes du genre Streptomyces, à un pH compris entre 5,0 et 8,0, afin d'obtenir le composé ou les composés de formule (I) qui le cas échéant sont isolés, purifiés et / ou salifiés, les composés de formules (I) ou (II) pouvant être sous les deux formes énantiomères possibles, isolés ou en mélanges. L'astérisque indique la position du carbone asymétrique. Un objet particulier de l'invention est un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus, dans lequel le Absidia corymbifera est Absidia corymbifera LCP 63-1800 ou dans lequel le Streptomyces est Streptomyces platensis NRRL 2364. Fexofénadine est un mélange racémique des énantiomères de formule (I). Un objet plus particulier du procédé est par conséquent le procédé tel que décrit précédemment dans lequel on effectue une bioconversion de la Terfénadine, correspondant à un mélange racémique des deux énantiomères de formule (II) est effectuée afin d'obtenir la Fexofénadine, correspondant à un mélange racémique des énantiomères de formule (I). Absidia corymbifera et en particulier corymbifera Absidia LCP 63-1800 sont disponibles auprès du Laboratoire de Cryptogamie du Musée d'Histoire Naturelle de Paris [Le Laboratoire Cryptogam au Musée d'Histoire Naturelle de Paris]. Parmi les Streptomyces qui peuvent être utilisés dans le processus, ce qui est un sujet de cette application, le Streptomyces suivant peut être mentionné: Streptomyces ATCC 15154 Streptomyces ATCC 31771 ATCC 10762 Streptomyces Streptomyces DSM 40130 Streptomyces fradiae W3554 Streptomyces griseus NRRL B150 Streptomyces JSP-2 (FH2126) JT46 / pCS2 de Streptomyces Streptomyces FH 2102 Streptomyces ATCC 3335 Streptomyces platensis ATCC 13865 Streptomyces platensis NRRL 2364 Streptomyces rimosus 2234 Streptomyces venezuelae NRRL B-2446. Il est connu de l'homme de l'art que l'extrême simplicité des cellules bactériennes, sans noyau distinct, leur permet d'être classés comme des procaryotes. Ceci est le cas pour les Streptomyces, bactéries filamenteuses, qui sont aérobies et gram-positif. D'autre part, les autres micro-organismes eucaryotes sont appelés suchas, par exemple, les champignons filamenteux et notamment Absidia corymbifera tout. Leurs cellules se différencient en particulier des procaryotes par la présence d'un noyau et de nombreux organites cytoplasmiques. Le procédé décrit ci-dessus, qui est un objet de la présente demande, présente de nombreux avantages. D'une part, il évite la voie chimique qui nécessite de nombreuses étapes de synthèse, accompagnés par des procédés d'isolement nécessaires à chacune de ces étapes réactionnelles. Dans le cas d'une utilisation industrielle, cet itinéraire peut se révéler coûteuse et polluante. Dans le cas du procédé qui fait l'objet de la présente demande, une seule opération est nécessaire et l'étape de purification facultative essentiellement a seulement pour but d'éliminer un produit secondaire qui peut se former lors de la bioconversion, à savoir le triolphosphate qui correspond à l'alcool non encore oxydé en acide, estérifié sous la forme d'un phosphate (formule (IIIb)) décrit plus bas. D'autre part ce procédé se prête bien à une utilisation industrielle. En opérant avec une concentration de produit de 0,5 g / l de départ, le rendement est supérieur à 70% par rapport au produit de départ. Parmi les autres avantages de l'utilisation de la voie microbiologique contre la voie chimique, l'aspect non polluant de cette technique peut être souligné, toutes les opérations qui se déroulent dans des milieux aqueux. La purification est effectuée selon les méthodes connues de l'homme du métier. Il peut être une purification par cristallisation, par chromatographie ou par résine échangeuse d'ions. Les réactions de salification peuvent être réalisées dans les conditions usuelles. Par exemple, l'opération peut être effectuée en présence de soude éthanolique. Un sel de sodium peut également être utilisé, tel que le carbonate de sodium ou de potassium ou le carbonate acide. Les sels obtenus peuvent être des sels de métaux alcalins ou alcalino-terreux ou d'ammonium éventuellement substitué. La mise en oeuvre de l'oxydation est effectuée selon les méthodes qui sont actuellement utilisées pour l'oxydation microbiologique des molécules organiques à l'aide de cultures de champignons filamenteux (Hollande HL, la synthèse organique avec des enzymes oxydatives éditeur VCH, Inc., New York, 1992;. Lacroix I, Biton J et Azerad R, Microbial biotransformation d'un agent immunomodulateur synthétique HR325, Bioorg Med Chem (1997) 7, 1369-1380;... Sebek OK, transformations fongiques comme une méthode utile pour la synthèse organique de composés organiques, Mycologia 75 ( 2) 383-394, 1983; Azerad, modèles R. microbiens pour le métabolisme des médicaments, Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology Vol 63, à la page 169, 1999... Ainsi, d'une part, les conditions de fermentation les plus favorables sont déterminés par voie analytique, en particulier par chromatographie en couche mince ou HPLC, dans des essais préalables, tels que par exemple le choix du milieu nutritif, du solvant de substrat approprié, la concentration du substrat, les conditions techniques telles que température, aération, pH, et des périodes optimum pour la culture, l'addition du substrat et le contact du substrat avec le micro-organisme. Dans une première phase, la culture est réalisée à partir d'un inoculum (spores ou mycélium) d'Absidia corymbifera LCP 63-1800 ou d'une bactérie du genre Streptomyces, en particulier Streptomyces platensis NRRL 2364, dans un milieu nutritif liquide à un pH initial de 5 à 7 et à une température comprise entre 20 et 30 ° C, de préférence entre 26 et 28 ° C. l'aération est assurée par agitation rotative des récipients de culture (150 à 250 rpm) ou, dans la cuve de fermentation, par l'introduction d'air à une vitesse d'environ 1 l / min débit et par litre de milieu de culture en bouillon. Après un temps variant de 24 à 72 heures, de préférence 60 à 65 heures, la terfénadine est ajouté à une concentration de 0,1 à 1 g / litre, de préférence de 0,4 à 0,6 g / litre, en solution dans un solvant organique qui est miscible à l'eau tel que l'éthanol, l'acétone, le tétrahydrofuranne, le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde (5 à 20 ml / litre de culture), de préférence l'éthanol (10 ml / litre). L'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions que la culture. Le pH est éventuellement réajusté et maintenu à une valeur de 5,0 à 8,0. La transformation du substrat est avantageusement suivie par analyse par HPLC du surnageant d'incubation ou chromatographie en couche mince d'échantillons extraits par un solvant organique. En général après 48 à 200 heures, des quantités suffisantes de fexofénadine ont été formés. Une autre procédure consiste à séparer la biomasse du milieu de culture par filtration, lavage avec de l'eau ou une solution tamponnée à un pH neutre, puis remise en suspension dans un tampon approprié, par exemple un tampon phosphate 0,05 M à pH 7, puis ajouter le substrat et en poursuivant l'incubation comme décrit précédemment. L'isolement et la purification des produits du procédé est effectuée d'une manière qui est connue en soi. Par exemple, les produits du procédé peuvent être extraits avec un solvant organique, de préférence l'acétate d'éthyle, ou par adsorption sur une colonne hydrophobe, suivie d'une élution avec un solvant organique, à évaporer le solvant organique, séparer et purifier les produits par chromatographie sur colonne ou par cristallisation. Par conséquent, un objet plus particulier de l'invention est le procédé tel que décrit précédemment dans lequel les conditions de biotransformation sont les suivantes: concentration en terfenadine ajoutée de 0,5 g / l à 10 g / l et de préférence entre 0,5 g / l à 5 ​​g / l, pH évoluant entre 5,0 et 8,0, température comprise entre 26 ° C et 28 ° C et aération par introduction d'un débit d'air d'environ 1 1 / min. et par litre de milieu de bouillon de culture. L'un des objectifs de l'invention est d'ajuster le pH pendant l'incubation et éventuellement le maintenir à une valeur optimisée, en vue de minimiser la formation de sous-produits. La conversion du Terfénadine (II) en Fexofénadine (I) par A. corymbifera ou S. platensis implique plusieurs étapes successives, avec la formation intermédiaire du triol (IIIc) et celle de deux produits secondaires indésirables, la terfénadine-phosphate (IIIa) et triolphosphate (IIIb) selon le schéma ci-dessous: L'oxydation initiale de la terfénadine (I) en triol (IIIc), produit par le micro-organisme dans le milieu d'incubation, est favorisée par un pH légèrement acide ou neutre (67) (tableau 5, fig. 1). En conséquence, il existe plusieurs stratégies possibles pour transformer la quasi-totalité de la terfénadine à fexofénadine (si on ne tient pas compte de la très faible quantité de terfénadine-phosphate formé): procéder d'abord à l'incubation dans le milieu de culture initial à un pH d'environ 6,5, sans contrôle du pH, ce qui conduit (en même temps que le pH évolue vers 8,0-8,5) à une transformation complète de la terfénadine en un mélange stationnaire stable de triol-phosphate (IIIb) et de fexofénadine (Fig. 2) (exemples 2 et 3), puis abaisser le pH à une valeur comprise entre 3,5 et 4 afin de favoriser la transformation de (IIIb) à (IIIc) et lui permettant de lentement et spontanément remonter vers 6,0, jusqu'à disparition complète du triol-phosphate (IIIb), puis réajuster et maintenir le pH dans la zone de 8,0, jusqu'à transformation du triol (IIIc) en fexofénadine (Fig. 3) (exemple 4 ). en procédant de la même manière à une incubation dans le milieu de culture, initialement à un pH d'environ 6,5, sans contrôle du pH, (le pH évolue naturellement vers 8,0-8,5) puis abaisser et maintenir à une valeur comprise entre 6,0 et 6,5, au cours de laquelle le pH du triol-phosphate (IIIb) est assez rapidement hydrolysé, comme résultat de l'équilibre des activités phosphatase-phosphorylase à ce pH, tandis que le triol (IIIc) est lui-même assez rapidement oxydé, jusqu'à transformation presque complète en fexofénadine (fig . 4) (exemple 5). Un objet plus particulier de l'invention est donc de: un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel le pH initialement à environ 6,5, évolue naturellement à 8,0-8,5, ce qui conduit à un mélange de triol-posphate (IIIb) et un composé de formule (I), est ensuite abaissé à une valeur comprise entre 3,5 et 4 afin de favoriser la transformation du composé intermédiaire de formule (IIIb) en composé intermédiaire de formule (IIbc), puis évolue naturellement à environ 6,0 jusqu'à la disparition complète du composé (IIIb), et enfin est réajusté et maintenu à environ 8,0 jusqu'à transformation du composé (IIIc) à fexofénadine. un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel le pH initial est d'environ 6,5 évolue naturellement à 8,0-8,5, est ensuite abaissée et maintenue à une valeur comprise entre 6,3 et 6,8. un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel, pendant l'étape de purification, l'extraction du produit de formule (I) est effectuée dans l'acétate d'éthyle. Enfin, un objet de l'invention est aussi, en tant que composé intermédiaire, le composé de formule (IIIc), telle que définie ci-dessus. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Préparation de la culture différente des médias Milieu A: maïs liqueur forte, 10 ml; NaNO 3. 2 g; MgSO 4 7H 2 O, 0,5 g; FeSO 4, 7H 2 O, 0,02 g; KCl, 0,5 g pour 900 ml d'eau distillée. tampon phosphate (K 2 HPO 4 2 g;.. KH 2 PO 4 1 g dans 40 ml d'eau distillée) et glucose, 30 g dans 60 ml d'eau distillée, ajoutés au moment de l'ensemencement. B Medium: Soya peptone, 5 g; extrait de levure, 5 g; MgSO 4 7H 2 O, 0,5 g; NaNO 3. 2 g; KCl, 0,5 g; FeSO 4, 7H 2 O, 0,02 g pour 900 ml d'eau distillée. tampon phosphate (K 2 HPO 4 2 g;.. KH 2 PO 4 1 g dans 40 ml d'eau distillée) et glucose, 30 g dans 60 ml d'eau distillée, ajoutés au moment de l'ensemencement. Medium C: Soya peptone, 5 g; extrait de levure, 5 g; NaCl, 5 g; K 2 HPO 4. 5 g pour 900 ml d'eau distillée. Glucose, 100 ml d'une solution à 200 g / L ajoutés au moment de l'ensemencement. D Medium: liqueur de maïs macéré, 10 ml; soja peptone, 5 g; NaNO 3. 2 g; MgSO 4 7H 2 O, 0,5 g; FeSO 4, 7H 2 O, 0,02 g; KCl, 0,5 g pour 900 ml d'eau distillée. tampon phosphate (K 2 HPO 4 2 g;.. KH 2 PO 4 1 g dans 40 ml d'eau distillée) et glucose, 30 g dans 60 ml d'eau distillée, ajoutés au moment de l'ensemencement. Moyen E: Milieu C ajusté à pH 7 avec HCl concentré, avant stérilisation. EXEMPLE 1 Etude des différents micro-organismes (Screening) Pour le criblage, des flacons de 250 ml Erlenmeyer contenant 100 ml de milieu de culture sont ensemencés avec une suspension de spores fraîchement récoltés sur milieu solide et la croissance est réalisée dans un incubateur rotatif à 27 ° C et à 200 tours par minute pendant 66 heures. La Terfénadine est ajoutée en solution dans l'éthanol (10 ml / litre) à une concentration finale de 0,2 g / l directement à la biomasse dans son milieu de culture. L'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions que la culture pendant 7 jours. a) Méthodes d'analyse Des prélèvements réguliers (1 ml par jour) du surnageant sont prélevés au cours de l'incubation, on centrifuge, microfiltrées et injecté dans HPLC sur une colonne de nucléosil C18 (250 x 4 mm; débit: 1 ml / min, détection à 220 nm et à 60 ° C .; le solvant est un acide trifluoroacétique à acétonitrile-eau (TFA) à partir du gradient constitué de CH3CN-eau-TFA (100: 900: 1) (solvant A) et CH3 CN-eau-TFA (900 : 100: 1) le mélange (solvant B). Dans ces conditions, la terfénadine (II) a un temps de rétention de 14,56 min. terfénadine-P (IIIa), un temps de rétention de 11,8 min. triol (IIIc), un temps de rétention de 9,61 min. fexofénadine, un temps de rétention de 9,45 min. et le triol-P (IIIb), un temps de rétention de 7,43 min. b) Les résultats de l'examen préalable La réalisation d'un examen préalable dans les conditions de culture décrit ci-dessus produit, entre autres souches testées, les résultats indiqués dans le tableau ci-dessous et on laisse 2 souches Absidia corymbifera LCP 63-1800 et Streptomyces platensis NRRL 2364 se trouvent, qui sont capables de produire fexofénadine dans un erlenmeyer avec un bon rendement, mais en présence d'une quantité non négligeable de triol phosphate et de triol. (A): Seuls les surnageants de culture ont été testés, ce qui explique l'absence de terfénadine adsorbée sur le mycélium. c) Purification et caractérisation complète de la fexofénadine Formé par Absidia Cozymbifera LCP 63,1800 A partir d'un erlen d'Absidia corymbifera (100 ml-20 mg de terfénadine), après filtration du mycélium et lavage à l'eau, le surnageant est saturé au NaCl puis extrait 3 fois avec de l'acétate d'éthyle; la phase organique est séchée sur MgSO 4 puis évaporée sous pression réduite pour produire 27 mg d'un résidu solide blanchâtre qui est purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (230-400 mesh) en utilisant le solvant CH 2 Cl 2 - MeOH - NH 4 OH (82,5: 15: 2,5). 12,4 mg de produit pur est récupéré identique à fexofénadine authentique. Point de fusion: 190-195 ° C d) Etude structurale de la fexofénadine obtenue en utilisant Absidia Corymbifera LCP 63-1800 RMN 1 H (CD3 OD, 250,13 MHz) Δ, ppm: 1,49 (6H, s, 2 CH3), 1,55 à 1,82 (8H, m, H-9, H-10 et H-13), 2,73 à 2,85 (4H, m, H-12), 3,30 à 3,32 (2H, m, H-11), 4,60 (1H, dd, J = 5,57 et 5,97 Hz, H-8), 7,17 (2H, d, J = 7,17 Hz, H-5), 7,29 (6H, dd, J = 7,17 et 7,97 Hz, H-18, H-19 et H-20), 7,39 (2H, d, J = 8,37 Hz, H-6), 7,53 (4H, d, J = 7,57 Hz, H-17 et H-21). RMN 13C (CD3OD, 62,9 MHz) Δ, ppm: 23,7 (CH2 C-10.), 27,1 (2 CH2 C-13.), 30,2 (2 CH3 C-3.), 39,0 (CH 2. C-9), 44,9 (CH, C-14), 50,9 (quat. C, C-2), 55,4 (2 CH2. C-12), 59,5 (CH 2. C-11), 75,9 ( CH, C-8), 81,7 (C quat, C-15), 23,7 (CH2 C-10), 128,6..; 123,9; 129,4 et 131,0 (CH, C-5, C-6, C-17, C-18, C-19, C-20 et C-21), 145,2; 149,2 et 150,3 (quat. C, C-4, C-7 et C-16), 186,3 (quat. C, C-1). SM (électropulvérisation à ions négatifs) m / z: 500 (M-H +), 456 (M-H + CO 2), 378 (456-C 6 H 6) Exemple 2 Microbiological Préparation de la fexofénadine Dix erlenmeyers de 250 ml contenant 100 ml de milieu D sont ensemencés par A. corymbifera LCP 63-1800. 50 mg de Terfénadine dans 1 ml d'éthanol, on ajoute dans chaque erlenmeyer. À J + 7, les 10 erlens sont filtrés sur gaze (le surnageant a un pH égal à 8,0), et la saturation avec du chlorure de sodium est réalisée pendant 2 heures (pH = 5-6), suivie par l'extraction avec 3 fois éthyle acétate d'éthyle et on sèche sur sulfate de magnésium. Après évaporation sous pression réduite, 409 mg de produit brut attendu est obtenu (rendement = 77%, environ 90% de produit pur). Ce produit est purifié sur une colonne de gel de silice (230-400 mesh, 40 g de silice, diamètre = 3 cm), en éluant avec un mélange chlorure de méthylène / méthanol / hydroxyde ammonlum (82.5-15-2.5). 312 mg de fexofénadine pur est récupéré (61,4%). Exemple 3: Préparation de la fexofénadine en fermenteur (milieu A) La culture d'Absidia coryymbifera est réalisée dans le milieu A (pH 6,5), mais dans une cuve de fermentation Biolafitte, dans un volume de 5 litres inoculé avec 2.10 6 spores / litre, à 27 ° C avec un débit d'air d'environ d'écoulement 5 litres / min. et l'agitation (turbine hélicoïdale) de 275 tours / min. La biomasse obtenue après 66 heures de culture et qui se présente sous la forme de pellets homogènes de 1 mm environ de diamètre a été utilisée pour la bioconversion directement dans le fermenteur de culture. On ajoute 1,25 g de Terfénadine dans 50 ml d'éthanol et l'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions pendant 7 jours. A ce stade, le pH est de 8,5 et le milieu d'incubation contient 35% de fexofénadine et 65% de triolphosphate. La biomasse est séparée du milieu liquide par filtration. Le filtrat est saturé en NaCl, son pH est ajusté à 6,0 avec du HCl dilué et on l'extrait 3 fois avec de l'acétate d'éthyle. Après purification comme décrit dans l'exemple 2, 350 mg (27%) de fexofénadine pure est récupérée. Le triolphosphate (IIIb) dans la phase aqueuse peut être récupéré par adsorption sur une colonne de XAD-2 et élution avec le méthanol. Exemple 3: Préparation de la fexofénadine en fermenteur (milieu D) La culture d'Absidia corymbifera est réalisée dans le milieu D (pH 6,5), dans une cuve de fermentation Biolafitte, dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3. La biomasse obtenue après culture pendant 66 heures est utilisée pour la bioconversion directement dans la culture de fermentation navire. On ajoute 1 g de Terfénadine dans 25 ml d'éthanol et l'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions pendant 4 jours. A ce stade, le pH est de 8,0 et le milieu d'incubation contient 70% de fexofénadine et 30% de triolphosphate qui sont isolés et purifiés comme décrit dans l'exemple 3. EXEMPLE 4 Méthode avec ajustements successifs du pH pour la préparation de la fexofénadine en Ermentation La culture d'Absidia corymbifera est réalisée dans le milieu D (pH 6,5), dans les conditions décrites dans l'exemple 3. 2,5 g de Terfénadine dans 50 ml d'éthanol sont ajoutés et l'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions pendant 4 jours. A ce stade, le pH est de 8,0 et le milieu d'incubation contient 42% de fexofénadine, 13% de triol (IIIc) et 25% de triolphosphate (IIIb). Le pH est ajusté à 3,5 avec du HCl concentré et l'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions en laissant le pH du milieu évoluer librement jusqu'à 6 (3 jours). A ce stade, le triol-phosphate (IIIb) a pratiquement totalement disparu au profit de la triol. On réajuste le pH à 8,0 et l'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions pendant 2 jours. Le milieu contient alors 85% de fexofénadine et 13% de triol phosphate (IIIb). EXEMPLE 5 Méthode optimisée pour la préparation de la fexofénadine en fermenteur La culture d'Absidia corymbifera est réalisée dans le milieu D (pH 6,5), dans les conditions décrites dans l'exemple 3. 2,5 g de Terfénadine dans 50 ml d'éthanol sont ajoutés et l'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions pendant 4 jours. A ce stade, le pH est de 8,0 et le milieu d'incubation contient 35% de fexofénadine, 11,5% de triol (IIIc) et 34% de triolphosphate (IIIb). Le pH est ajusté et maintenu à 6,0-6,5 avec HCl dilué pendant qu'on continue l'incubation dans les mêmes conditions (3 jours). Le milieu contient alors 89,5% de fexofénadine et 9,5% de triol phosphate. EXEMPLE 6 Un flacon Erlenmeyer de 250 ml contenant 100 ml de milieu E est ensemencé avec Streptomryces platensis NRRL 2364 et on cultive comme décrit dans l'exemple 1. La moitié du milieu de culture et de la biomasse, dont le pH est de 5,0, a 10 mg de terfénadine dissoute dans 0,5 ml d'éthanol et on ajoute à l'incubation est poursuivie pendant plusieurs jours dans les mêmes conditions. Au bout de 3 jours, le seul métabolite observé est le triol (IIIc) (60%); après 7 jours le rendement en triol atteint 67%. EXEMPLE 7 L'autre moitié du milieu de culture et de la biomasse de l'exemple 6, a terfénadine (10 mg dans 0,5 ml d'éthanol) a été ajouté à cela et mis en incubation dans les mêmes conditions que dans l'exemple 6, pendant 3 jours, puis amenée à pH 8,0 par addition de 7,5 M NaOH. L'incubation est poursuivie pendant 4 jours et 16% de triol-phosphate (IIIb), 37% de fexofénadine (I) et 26% de triol (IIIc) sont obtenus. EXEMPLE 8 Préparation de la fexofénadine en Fermentation La préculture est réalisée en milieu minimum (la source de carbone est le glucose) dans des erlenmeyers de 500 ml contenant 100 ml de milieu stérile. Les erlens sont ensemencés avec 450 ul d'une suspension glycérolée de Streptomyces platensis NRRL 2364 (stock congelé à -80 ° C) et incubés dans un agitateur orbital (2,5 cm de la taille de l'orbite) à 34 ° C 250 tours par minute pendant 75 heures. La fermentation est effectuée dans des cuves de fermentation avec un volume total de 500 ml contenant 300 ml de milieu minimum à 125 g / l de glucose. La cuve de fermentation est inoculé avec 7,5 ml de la préculture décrite ci-dessus. Les conditions de culture sont les suivantes: Température a été ajustée à 34 ° C agitation constante (pas de régulation de pO2) aération constante à 54 l / h (3vvm) PH ajusté à 6,0 par addition de KOH à 20% Après 48 heures de culture, 75 mg de terfénadine solubilisée dans 3 ml d'éthanol est ajoutée. La culture est poursuivie jusqu'à 212 heures se sont écoulées. Pour ce test, la terfénadine et ses dérivés sont analysés par HPLC en phase inverse, après dilution du milieu de bouillon de culture à 1/10 dans l'éthanol. À 212 heures 71% d'avancement de la réaction est obtenue (fexofénadine formée) et un bilan estimé à 82%.

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